高效液相色譜儀含量測定：從核心原理到實戰(zhàn)計算，一文讀懂HPLC定量分析

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作者：依利特 來源：液相售后 2025-12-15 10:47:16

在藥品研發(fā)、食品安全、環(huán)境監(jiān)測和化工分析等領(lǐng)域，高效液相色譜儀（HPLC） 是進行精準定量分析的“黃金標準”工具。無論是檢測藥品的有效成分，還是分析食品中的添加劑含量，其終的含量測定結(jié)果都至關(guān)重要。本文將深入淺出地解析HPLC含量測定的核心原理、關(guān)鍵計算公式，并解答三個令實驗人員頭疼的實戰(zhàn)問題，助您夯實基礎(chǔ)，提升分析效率與準確性。




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一、核心原理：分離與比較的藝術(shù)

HPLC含量測定本質(zhì)上是一個 “先分離，后比較” 的過程。

高效分離：待測樣品經(jīng)進樣器進入色譜柱。由于各組分在流動相（液體）和固定相（柱內(nèi)填料）間的分配能力不同，在高壓泵送的流動相帶動下，各組分以不同速度遷移，從而實現(xiàn)高精度分離。

精準檢測：流出色譜柱的組分進入檢測器（如紫外檢測器），其濃度信號被轉(zhuǎn)化為電信號，形成一個個色譜峰。

定量依據(jù)：這是定量的基石——在一定濃度范圍內(nèi)，組分的峰面積（A）或峰高（h）與其濃度（c）成正比。通過與已知濃度的標準品（對照品）進行比較，即可計算出未知樣品的含量。


二、兩大經(jīng)典方法及計算公式詳解

1. 外標法——直接的對比法

原理：直接用樣品中待測組分的信號與對照品的信號進行比較。

單點校正公式（適用于濃度接近時）：

含量（%）= (A樣 / A對) × (c對 / c樣) × 100%

（A：峰面積；c：溶液濃度）

標準曲線法（更通用、更準確）：

首先用一系列不同濃度的對照品繪制標準曲線（線性方程：y = ax + b，y為峰面積，x為濃度）。將樣品的峰面積代入，求得其溶液濃度c樣測，再通過下式計算：

含量（%）= (c樣測 × V × D / W) × 100%

（V：樣品定容體積；D：稀釋倍數(shù)；W：樣品稱樣量）


2. 內(nèi)標法——抵消誤差的精密法

原理：在樣品和對照品中加入已知量、性質(zhì)接近的內(nèi)標物，通過比較待測物與內(nèi)標物的峰面積比值來定量。此法可有效抵消進樣誤差和前處理損失。

核心公式：

先由對照品求校正因子 F = (A內(nèi)標對 / A對) × (c對 / c內(nèi)標)

再計算樣品含量 含量（%）= F × (A樣 / A內(nèi)標樣) × (c內(nèi)標 / c樣) × 100%

掌握HPLC含量測定的原理與計算，并深刻理解實驗中的關(guān)鍵細節(jié)和常見問題，是獲得可靠數(shù)據(jù)的前提。無論您是分析新手還是經(jīng)驗豐富的工程師，從精準的樣品前處理、嚴謹?shù)臉藴是€建立，到對儀器狀態(tài)的敏銳洞察，每一步都決定著分析的成功與否。希望本文能成為您HPLC定量分析工作中的實用指南，助您攻克難關(guān)，讓每一次檢測都精準無誤。


對比維度外標法內(nèi)標法
核心原理樣品與對照品直接信號比對引入內(nèi)標物，通過比值定量
適用場景進樣精度高、前處理穩(wěn)定的樣品進樣誤差大、前處理易損失的樣品
優(yōu)勢操作簡單、計算便捷，無需額外內(nèi)標物可抵消進樣/前處理誤差，結(jié)果更精密
局限性易受進樣量波動影響需篩選合適內(nèi)標物，操作稍復(fù)雜
數(shù)據(jù)要求需保證標準曲線線性良好需保證內(nèi)標物與待測物分離度達標

表1.HPLC含量測定兩大經(jīng)典定量方法對比


方法類型具體公式公式中參數(shù)含義
外標法-單點校正含量（%）= (A樣/A對)×(c對/c樣)×100%A樣：樣品峰面積；A對：對照品峰面積；c對：對照品溶液濃度；c樣：樣品溶液濃度
外標法-標準曲線含量（%）= (c樣測×V×D/W)×100%c樣測：標準曲線求得的樣品濃度；V：樣品定容體積；D：稀釋倍數(shù)；W：樣品稱樣量
內(nèi)標法校正因子F=(A內(nèi)標對/A對)×(c對/c內(nèi)標)；含量（%）=F×(A樣/A內(nèi)標樣)×(c內(nèi)標/c樣)×100%A內(nèi)標對：對照品溶液中內(nèi)標峰面積；A內(nèi)標樣：樣品溶液中內(nèi)標峰面積；c內(nèi)標：內(nèi)標物濃度

表2.HPLC含量測定核心計算公式匯總


操作環(huán)節(jié)質(zhì)量控制要求常見失誤點
樣品前處理1. 稱樣使用校準天平，精度符合要求；2. 樣品完全溶解并經(jīng)0.45μm濾膜過濾；3. 定容操作規(guī)范天平未校準、樣品未完全溶解、定容液面未達標
標準曲線建立1. 對照品濃度梯度覆蓋樣品實際濃度；2. 至少5個濃度點，線性相關(guān)系數(shù)r≥0.999；3. 同濃度平行樣RSD≤2%濃度梯度范圍不合理、平行樣偏差大
儀器狀態(tài)校驗1. 泵流速波動≤1%；2. 紫外檢測器燈能量充足；3. 色譜柱柱溫波動≤0.5℃；4. 系統(tǒng)壓力穩(wěn)定流速不穩(wěn)、檢測器能量不足、柱溫波動大
數(shù)據(jù)積分1. 積分參數(shù)（峰起點/終點、斜率靈敏度）統(tǒng)一；2. 排除基線噪音和雜質(zhì)峰干擾積分參數(shù)不統(tǒng)一、雜質(zhì)峰誤計入目標峰

表3.HPLC含量測定關(guān)鍵操作質(zhì)量控制點



實戰(zhàn)中必知的3個常見問題（Q&A）

Q1：標準曲線在高濃度點不呈線性了，怎么辦？

A：這通常是檢測器響應(yīng)飽和或色譜柱過載的信號。解決方案：首先將樣品溶液適當稀釋，使其落入線性范圍。同時，重新評估并建立覆蓋實際樣品濃度的標準曲線范圍。確保儀器狀態(tài)良好，必要時可驗證非線性擬合的適用性。


Q2：峰面積重現(xiàn)性差（RSD超標），如何系統(tǒng)排查？

A：這是多因素問題，建議按以下順序排查：

首要檢查進樣系統(tǒng)：自動進樣器針頭是否堵塞或有氣泡？手動進樣操作是否規(guī)范？

檢查樣品溶液：是否穩(wěn)定？是否完全溶解、過濾？現(xiàn)配現(xiàn)用。

確認色譜系統(tǒng)穩(wěn)定性：泵流速是否穩(wěn)定？檢測器（尤其是紫外燈）能量是否充足？柱溫是否恒定？

復(fù)核積分參數(shù)：確保色譜數(shù)據(jù)處理軟件中的積分方法設(shè)置一致、合理。


Q3：外標法中，樣品前處理的“定容”體積不準，影響大嗎？

A：影響巨大且是直接影響。從公式 含量（%）= (c樣測 × V × D / W) × 100% 可見，定容體積（V）與計算結(jié)果成正比。例如，100mL定成99mL，結(jié)果就會產(chǎn)生約1%的正偏差。關(guān)鍵操作：務(wù)必使用經(jīng)過校準的A級容量瓶，并嚴格按照“液面凹緣與刻度線相切”的要求進行定容，這是保證數(shù)據(jù)準確的生命線。


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