高效液相色譜（HPLC）技術(shù)詳解：組成、工作流程及分類

高效液相色譜（HPLC）是一種利用混合物中各組分在固定相和流動(dòng)相之間分配系數(shù)的不同來實(shí)現(xiàn)分離分析的技術(shù)。它效率高、速度快、靈敏度也高，在很多領(lǐng)域都有著非常重要的作用。?在制藥行業(yè)，HPLC 能用于藥物的質(zhì)量控制，像檢測藥物的純度、含量以及里面雜質(zhì)的種類和數(shù)量，確保藥品用起來安全有效；在環(huán)境監(jiān)測時(shí)，它可以精準(zhǔn)分析水體、土壤中的污染物，給環(huán)境保護(hù)提供科學(xué)的參考；在食品分析方面，能檢測食品里的添加劑、農(nóng)藥殘留、獸藥殘留等，保障我們吃的東西安全。?可以說，HPLC 在分離分析領(lǐng)域地位關(guān)鍵，它能把那些用其他方法很難分離的復(fù)雜混合物分離開，還能準(zhǔn)確測定微量成分，給科研、生產(chǎn)和質(zhì)量控制等工作提供了有力的技術(shù)支持。?

一、高效液相色譜儀的主要組成?

（一）流動(dòng)相輸送系統(tǒng)（泵系統(tǒng)）?

它的作用是給整個(gè)色譜分析過程提供穩(wěn)定、高壓的流動(dòng)相流速，讓流動(dòng)相能以均勻的速度通過色譜柱，這樣才能保證分離效果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。?

關(guān)鍵部件有這些：?

高壓泵（比如二元泵、四元泵）：二元泵有兩個(gè)獨(dú)立的泵頭，能按一定比例混合兩種流動(dòng)相；四元泵則能混合四種流動(dòng)相，滿足更復(fù)雜的梯度洗脫需求，而且它們都能提供高壓，讓流動(dòng)相順利通過色譜柱，克服柱阻力。?

脫氣機(jī)：流動(dòng)相在儲(chǔ)存和輸送時(shí)很容易溶解空氣，產(chǎn)生氣泡，這些氣泡會(huì)影響泵的正常工作，還會(huì)讓檢測器的信號(hào)不穩(wěn)定。脫氣機(jī)就是用來除掉流動(dòng)相里的氣泡，保證系統(tǒng)能穩(wěn)定運(yùn)行。?

梯度混合器：主要用于梯度洗脫，它能精確控制不同流動(dòng)相的比例隨時(shí)間變化，這樣就能更好地分離復(fù)雜樣品。比如分析一些極性差異大的化合物時(shí)，通過它改變流動(dòng)相的極性，能讓各組分在合適的時(shí)間被洗脫出來。?

（二）進(jìn)樣系統(tǒng)?

進(jìn)樣系統(tǒng)常見的類型有：?

手動(dòng)進(jìn)樣閥（六通閥）：由閥體和閥芯組成，轉(zhuǎn)動(dòng)閥芯實(shí)現(xiàn)流路切換。操作簡單、成本低，但進(jìn)樣結(jié)果的精度和重現(xiàn)性高度依賴操作者技巧，易受人為因素影響，適合小批量或?qū)ν恳蟛桓叩膱鼍啊?

自動(dòng)進(jìn)樣器：通過機(jī)械臂、高精度注射泵及傳感器自動(dòng)完成取樣、進(jìn)樣和清洗，消除了人為誤差，顯著提高了進(jìn)樣精度、重現(xiàn)性和通量，適用于大批量樣品的高效分析。?

（三）色譜柱?

核心部件包括：?

固定相（像 C18 反相柱）：C18 反相柱是常用的固定相，它的表面鍵合了十八烷基硅烷，具有非極性，適合分離非極性和中等極性的化合物。?

柱溫箱（控制溫度）：溫度對(duì)色譜分離效果影響挺大，柱溫箱能精確控制色譜柱的溫度，保證分離條件穩(wěn)定，讓分析結(jié)果的重現(xiàn)性更好。?

選擇色譜柱主要看分離目標(biāo)物的性質(zhì)，比如極性、分子量等。對(duì)于極性強(qiáng)的化合物，可以選正相色譜柱；非極性或中等極性的化合物，反相色譜柱更合適；而像蛋白質(zhì)、多肽這類大分子化合物，就需要選凝膠滲透色譜柱等。?

（四）檢測器?

常見的類型有：?

紫外 - 可見檢測器（UV-Vis）：它是根據(jù)物質(zhì)對(duì)紫外 - 可見光的吸收特性來檢測的，應(yīng)用很廣泛，對(duì)很多有機(jī)化合物靈敏度都比較高，但要求被檢測的物質(zhì)得有紫外 - 可見吸收基團(tuán)。?

熒光檢測器（高靈敏度）：它利用一些物質(zhì)在激發(fā)光照射下會(huì)發(fā)出熒光的特性來檢測，靈敏度比紫外 - 可見檢測器高 1-3 個(gè)數(shù)量級(jí)，適合痕量分析，比如檢測食品中的黃曲霉毒素。?

示差折光檢測器（通用型）：它通過檢測流動(dòng)相和樣品溶液之間的折射率差異來確定樣品濃度，對(duì)所有物質(zhì)都有響應(yīng)，但靈敏度較低，受溫度影響大，一般用于那些不能用其他檢測器檢測的物質(zhì)，比如糖類化合物。?

質(zhì)譜檢測器（MS，用于結(jié)構(gòu)鑒定和超痕量檢測）：它先把樣品離子化，然后根據(jù)離子的質(zhì)荷比進(jìn)行分離和檢測，不僅能對(duì)樣品進(jìn)行高靈敏度定量分析，還能提供化合物的結(jié)構(gòu)信息，在藥物研發(fā)、代謝組學(xué)等領(lǐng)域用得很多。?

（五）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)?

工作站軟件的作用是采集檢測器輸出的信號(hào)，生成色譜圖，然后對(duì)色譜圖進(jìn)行分析，比如計(jì)算峰面積、保留時(shí)間、峰高、分離度等參數(shù)，同時(shí)還能存儲(chǔ)、檢索數(shù)據(jù)和生成報(bào)告，給分析結(jié)果的處理和管理帶來了方便。?

（六）輔助部件?

過濾器：裝在泵和進(jìn)樣器之間，用來過濾流動(dòng)相里的顆粒雜質(zhì)，保護(hù)色譜柱不被污染，延長它的使用壽命。?

保護(hù)柱：連接在進(jìn)樣器和分析柱之間，它的固定相和分析柱相同或相似，能吸附樣品中的雜質(zhì)，減少分析柱的污染，讓分析柱用得更久。?

柱溫箱（保持溫度恒定）：前面也提到了，它能保證色譜柱溫度穩(wěn)定，提高分析結(jié)果的重現(xiàn)性。?

二、工作流程簡述?

流動(dòng)相輸送：泵系統(tǒng)把經(jīng)過脫氣和過濾的流動(dòng)相，以穩(wěn)定的壓力和流速輸送到色譜系統(tǒng)里。?

樣品注入：通過進(jìn)樣系統(tǒng)把一定量的樣品注入到流動(dòng)相中，樣品隨著流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱。?

色譜柱分離：樣品在色譜柱里和固定相、流動(dòng)相發(fā)生相互作用，因?yàn)楦鹘M分的分配系數(shù)不一樣，在色譜柱里的移動(dòng)速度就有差異，這樣就實(shí)現(xiàn)了分離。?

檢測器信號(hào)采集：分離后的各組分依次進(jìn)入檢測器，檢測器對(duì)它們進(jìn)行檢測，然后產(chǎn)生相應(yīng)的電信號(hào)。?

數(shù)據(jù)處理：數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)采集檢測器的信號(hào)，生成色譜圖，再對(duì)色譜圖進(jìn)行分析處理，得到樣品中各組分的相關(guān)信息。?

三、HPLC 的分類（可選擴(kuò)展）?

按分離機(jī)制來分，常見有這些類型：?

反相 HPLC：固定相的極性比流動(dòng)相小，適合分離非極性和中等極性的化合物，是目前用得廣泛的 HPLC 方法，比如用 C18 柱分離多環(huán)芳烴。?

正相 HPLC：固定相的極性比流動(dòng)相大，常用來分離極性化合物，比如分離糖類、氨基酸等。?

離子交換色譜：它是基于離子之間的靜電引力來分離的，固定相是離子交換樹脂，適合分離離子型化合物，像有機(jī)酸、生物堿等。?

體積排阻色譜：根據(jù)分子的大小來分離，固定相是多孔凝膠，小分子能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，保留時(shí)間長，大分子進(jìn)不去，保留時(shí)間短，適合分離大分子化合物，比如蛋白質(zhì)、聚合物等。

高效液相色譜儀的各個(gè)組件相互配合工作，共同影響著分析結(jié)果的準(zhǔn)確性、精密度和分離效果。流動(dòng)相輸送系統(tǒng)提供穩(wěn)定的流動(dòng)相條件，進(jìn)樣系統(tǒng)保證樣品能準(zhǔn)確注入，色譜柱實(shí)現(xiàn)樣品分離，檢測器把分離后的組分變成可檢測的信號(hào)，數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)信號(hào)進(jìn)行分析處理，輔助部件則起到保護(hù)和優(yōu)化系統(tǒng)性能的作用。?

維護(hù)和優(yōu)化各個(gè)部件對(duì)保證 HPLC 系統(tǒng)正常運(yùn)行和分析結(jié)果的可靠性非常重要。比如，要定期清洗和維護(hù)泵系統(tǒng)，防止泵壓波動(dòng)；要避免色譜柱被污染，及時(shí)更換過濾器和保護(hù)柱，使用合適的流動(dòng)相和樣品前處理方法；還要定期校準(zhǔn)檢測器，確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確。只有把各部件的維護(hù)和優(yōu)化工作做好，才能充分發(fā)揮 HPLC 技術(shù)的優(yōu)勢，給科研和生產(chǎn)提供可靠的分析數(shù)據(jù)。